從DNA結構的發(fā)現(xiàn)使得人們初步認識基因結構，到PCR技術的出現(xiàn)實現(xiàn)基因的體外擴增，再到基于PCR技術的基因測序技術使人們第一次看到了人類基因組庫的信息全貌。但是無論基因操作技術如何發(fā)展，都改變不了人們對基因編輯技術的狂熱追求，因為他直接關系到人類疾病的診斷和治療、優(yōu)生優(yōu)育以及人種的進化。 基因編輯技術大致經(jīng)歷了3個發(fā)展階段，以“鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）”、“類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）”為代表的第一、二代技術以及以CRISPR/Cas9為代表的源于細菌一種獲得性免疫系統(tǒng)的三代技術。CRISPR/Cas9技術相比前兩代技術，具有成本低、制作簡便、快捷高效的優(yōu)點，讓它迅速風靡于世界各地的實驗室。近年來應用CRISPR/Cas9技術發(fā)表的高水平文章達到了10000余篇，該技術也是目前唯一被驗證可應用于臨床治療的基因編輯技術，被譽為“基因超級剪刀”。

云克隆一直致力于基因編輯技術的開發(fā)和研究，有CRISPR/Cas9技術平臺及與之配套的慢病毒和腺病毒轉染平臺技術體系。CRISPR/Cas9基因編輯載體包含Cas9表達元件、sgRNA轉錄元件、篩選標記元件、原核復制元件等，導致轉染質粒偏大，采用傳統(tǒng)瞬時轉染技術轉染效率不高，而且效果不穩(wěn)定，難以達到預期目的, 但慢病毒和腺病毒轉染系統(tǒng)能很好的解決這個問題。慢病毒和腺病毒轉染系統(tǒng)中的病毒株系均采用可感染哺乳動物細胞的病毒改造而來，從而使他們變成了一個很好的基因載體，通過篩選重組病毒并進行富集，便可直接用于侵染目的細胞。在重組病毒對目的細胞進行侵染的過程中，CRISPR/Cas9結構就會隨著重組病毒基因組一并進入到目的細胞中（如圖1所示）。通過這個侵染過程，一方面保證了目的片段對目標細胞的轉染效率，另一方面借助病毒的表達原件實現(xiàn)了Cas9和sgRNA的高效表達和轉錄，以保證對目的細胞基因組特定位點的高效剪切（如圖2所示）。

我們采用慢病毒轉染和CRISPR/Cas9技術相結合，對MCF-7細胞BECN1基因進行定點編輯。首先我們選擇人BECN1基因的兩個外顯子區(qū)域中三個23堿基構成的CRISPR/Cas9靶序列（N20NGG）（如圖3所示），通過化學合成方法得到20nt的guide序列及其互補序列，sgRNA及其互補序列退火形成雙鏈，借助BsmBI單酶切和酶連構建含有sgRNA序列信息的LentiCRISPRv2重組載體（如圖4所示），LentiCRISPRv2中含有CRISPR/Cas9全部組件以及慢病毒的核心組件；接著LentiCRISPRv2重組載體和慢病毒的包裝質粒共同轉染293T細胞，在已共同轉染的293T細胞內(nèi)慢病毒自我包裝形成具有感染性的病毒顆粒，這些病毒顆?；蚪M中也會包含CRISPR/Cas9的全部組件。收集病毒顆粒直接侵染MCF-7細胞株，重組病毒基因組會插入MCF-7細胞基因組中，通過嘌呤霉素篩選，最終獲取穩(wěn)定轉染的MCF-7細胞株。在穩(wěn)定轉染的MCF-7細胞株內(nèi)，Cas9和sgRNA能夠被穩(wěn)定表達和轉錄，進而結合成剪切復合體，復合體被轉運進入細胞核，以完成對sgRNA互補DNA片段的剪切，到達對目的片段定向剪切目的（如圖5所示）。

對于基因敲除效果在蛋白水平的表現(xiàn)，我們通過WB做了進一步的驗證，直接選取篩選過的細胞作為驗證對象，通過WB技術半定量檢測了BECN1蛋白的含量。檢測結果如圖6所示，選取的三個sgRNA都對MCF-7細胞的BECN1基因產(chǎn)生的重新的編輯，通過人為創(chuàng)造的移碼突變使得BECN1蛋白的含量出現(xiàn)了顯著性的下調。

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?CRISPR/Cas9技術目前被廣泛的應用于基因敲除或基因敲入細胞系和動物的制備，以研究基因功能、疾病治療、物種改造等多個領域，具有非常廣泛的實踐使用價值。云克隆一直致力于CRISPR/Cas9技術在細胞系和動物方面的應用，并在技術方面進行了改進，能夠更高效、快速的獲取基因敲除或基因敲入細胞系和動物模型。

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