細胞transwell 遷移侵襲實驗方案

一、實驗?zāi)康模?/span> 

主要用于趨化因子家族或者某些補體以及某些具有趨化活性的蛋白活性檢測。

二、實驗儀器：

倒置顯微鏡 酶標(biāo)儀 超凈工作臺 CO₂培養(yǎng)箱

三、相關(guān)試劑、耗材：

24孔transwell小室  胎牛血清  DMEM/1640培養(yǎng)基 結(jié)晶紫 基質(zhì)膠

四、實驗步驟：

A. 細胞遷移  

1 . 將細胞消化，終止后離心棄去培養(yǎng)液，用 PBS 洗 1-2 遍，用無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細胞密度至 1~5×10⁵左右，每孔100-200μl加入小室上室中。

2. 下室加入用無血清培養(yǎng)基按5-10倍梯度稀釋的待檢測蛋白，每孔500μl。對于貼壁細胞，下室可加入含1-2% FBS低血清培養(yǎng)基。

3. 陽性對照孔的設(shè)置，下室加入10% FBS的培養(yǎng)基；陰性對照孔設(shè)置為下室加入不含待測蛋白不含血清的細胞培養(yǎng)基。

4.將transwell板放入5% CO₂ ，37℃培養(yǎng)箱中，60-90min后觀察結(jié)果。

B. 細胞侵襲  

1. 包被基質(zhì)膠，根據(jù)說明書上推薦的濃度進行稀釋包被transwell小室底部膜的上室面，4 ℃風(fēng)干。

2. 其它步驟同細胞遷移一樣，觀察實驗結(jié)果前需用棉簽擦掉transwell小室上的基質(zhì)膠

檢測方法：

1. 懸浮細胞穿過膜后會直接掉入下室，移除上室，用倒置顯微鏡觀察可直接計數(shù)，在高倍鏡下隨機選取5個視野進行計數(shù)，最后計算平均值?；蛘呤占率遗囵B(yǎng)液，用流式細胞儀計數(shù)。        

2. 貼壁細胞的計數(shù)：將上室培養(yǎng)液吸出，棄掉，等膜風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫染色，把Transwell小室反過來底朝上用正置顯微鏡觀察在高倍鏡下隨機選取5個視野進行計數(shù)或者用33%醋酸脫色，將結(jié)晶紫完全洗脫下來，洗脫液可在酶標(biāo)儀上570 nm 測其OD值，間接反映細胞數(shù)。

注意事項：

1. 根據(jù)趨化實驗的靶細胞選擇合適的趨化濾膜的孔徑，中性粒細胞用3μm孔徑的PVPF聚碳酸膜（ Polycarbonate membranes），單核細胞用8μm孔徑的PVPF聚碳酸膜，淋巴細胞則用5-8μm孔徑的PVPF。

2. 趨化時間，通常中性粒細胞趨化時間為30分鐘，單核細胞趨化時間為90分鐘，淋巴細胞趨化時間為180分鐘。具體趨化時間需要參考文獻或者根據(jù)實際實驗情況而定，貼壁細胞通常要24小時以上。

3. 趨化因子濃度的確定： 由于趨化因子的特異活性非常高，某些趨化因子在較高濃度時促進細胞趨化的作用反而降低，所以待測樣品常需連續(xù)稀釋（5倍或10倍系列稀釋）以獲得最適劑量的趨化結(jié)果。每次實驗都需設(shè)好對照，因為不同來源或不同活力靶細胞的趨化能力差異很大。趨化因子活性的表達方式有三種，其中最常用的是用趨化指數(shù)表示，趨化指數(shù)（chemotactic index,CI）是指細胞遷移到待測樣品液的數(shù)目和遷移到對照液的數(shù)目的比值。

4. 細胞侵襲常用8.0、12.0μm膜，有侵襲能力的細胞才可用于 Transwell 侵襲實驗，侵襲實驗前最好先檢測細胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達情況。