實驗原理

Caspase-3是一種蛋白酶，屬于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族，在細胞凋亡中起著不可替代的作用。caspase-3可以被多種因素活化，在CTL細胞的殺傷作用中，它既可被Fas/FasL途徑活化，也可以通過顆粒酶B途徑活化。顆粒酶B是CTL細胞顆粒中的一種絲氨酸酯酶，是哺乳動物中除caspase蛋白酶外唯一的在Asp后剪切的蛋白酶，它可以特異性剪切ICE家族蛋白酶催化亞單位C端的XXD序列，并活化caspase 2、3、6、7、8、9、10。Caspase-3能催化特異性底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide (Ac-DEVD-pNA)水解生成對硝基苯胺,通過在405nm對硝基苯胺發(fā)色強度的檢測來計算出caspase-3的活性大小。

試劑 

2x反應buffer: 50mmol/L HEPES，pH7.4

100mmol/L NaCl

10mmol/L DTT(二硫蘇糖醇)

2mmol/L EDTA

10% 甘油

儀器

96孔酶標板及酶標儀

實驗步驟

1底物溶解及稀釋：Ac-DEVD-pNA用DMSO溶解配成儲存液，臨用時用1X反應buffer稀釋成4mmol/L工作液，注意避光。

2對硝基苯胺儲存液：將對硝基苯胺用無水乙醇溶解后，用1X反應buffer稀釋配制成儲存液。

3將重組人的Caspase-3用1X反應buffer稀釋后，取50μl加入含有50μl的2x反應buffer的酶標板中，最后再加入5μl底物工作液，37℃水浴，避光反應2h。在405nm下讀取OD值。將200μM對硝基苯胺儲存液，用1X反應buffer進行2倍梯度稀釋，在405nm下讀取OD值，并繪制標準曲線。

 結(jié)果計算

酶活定義：caspase-3在1min內(nèi)水解產(chǎn)生1pmol對硝基苯胺為一個活性單位U。

比酶活：1μg caspase-3蛋白在1min內(nèi)水解產(chǎn)生1pmol對硝基苯胺，U/μg

將酶標儀測定OD值帶入對硝基苯胺繪制的標準曲線中計算得出的最終酶活

比酶活=pmol/min/μg

重組人caspase-3最終活性為2196pmol/min/ug。