細胞衰老是指對不同應激因素的反應而發(fā)生的不可逆轉(zhuǎn)的生長停滯。衰老細胞分泌多種因子，統(tǒng)稱為衰老相關(guān)分泌表型（SASP），線粒體是SASP分泌的主要調(diào)節(jié)器。線粒體是細胞凋亡所必須的，細胞凋亡是一種不同于細胞衰老的細胞命運，在細胞凋亡過程中，廣泛的線粒體外膜透化（MOMP）可介導細胞死亡。MOMP發(fā)生在線粒體的一個子集中，是細胞衰老的一個特征，這個過程稱為少數(shù)MOMP（miMOMP），需要BAX和BAK通道將線粒體DNA（mtDNA）釋放到胞漿中，胞漿mtDNA反過來激活cGAS-STING通路，這是SASP的主要調(diào)節(jié)因子，體內(nèi)抑制MOMP可以減少炎癥標志物并改善老年小鼠的健康壽命。發(fā)表在《Nature》上的題為“Apoptotic stress causes mtDNA release during senescence and drives the SASP”的最新研究探討了衰老細胞和受損細胞導致炎癥的原因，揭開了衰老過程背后的一些生物學秘密，并提供了一種潛在的新型治療靶標。

1. miMOMP是細胞衰老的一個典型特征

首先通過3D結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)（SIM）分析MOMP是否存在于衰老細胞中，檢測線粒體外膜蛋白TOM20和細胞色素c（Cyt c）在增殖和衰老的人成纖維細胞中的共定位關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)輻射誘導的衰老細胞（Sen IR）外周部分線粒體中TOM20和Cyt c的共定位關(guān)系減弱，同時發(fā)現(xiàn)，衰老細胞胞漿中Cyt c和cleaved caspase-3的含量增加且BAX被大量激活，這些數(shù)據(jù)都表明衰老期間部分線粒體會發(fā)生MOMP，研究團隊將這一現(xiàn)象稱為miMOMP。

                                                                                                                        圖1. miMOMP發(fā)生在細胞衰老過程中

2. 衰老細胞中miMOMP導致胞漿mtDNA釋放增加

研究團隊推測衰老細胞中miMOMP可能釋放mtDNA入胞漿。通過TOM20和DNA的免疫熒光雙染色及透射電鏡觀察免疫膠體金標記的DNA水平，結(jié)果均顯示衰老細胞中的胞漿DNA水平升高。接下來，則要明確這些升高的DNA是否來源于線粒體。通過qPCR檢測mtDNA標志物（D-loop）的表達在衰老細胞胞漿中升高，并發(fā)現(xiàn)衰老細胞中大部分胞漿DNA與線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）共定位，TFAM是mtDNA類核的核心成分之一。這些數(shù)據(jù)說明衰老細胞中miMOMP胞漿mtDNA釋放增加。

                                                                                                                               圖2. 衰老細胞中miMOMP釋放mtDNA入胞漿

3. BAX和BAK體內(nèi)外促進SASP的分泌

運用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了同時敲除BAX和BAK的人成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)BAX和BAK的敲除顯著抑制了衰老細胞中mtDNA的釋放。進一步研究BAX和BAK是否會影響SASP，進行了RNA-seq分析及細胞因子陣列分析，發(fā)現(xiàn)BAX和BAK的敲除抑制了SASP相關(guān)基因的表達，并降低了促炎細胞因子水平。研究人員又探究BAX和BAK的敲除是否影響衰老相關(guān)細胞周期阻滯途徑，發(fā)現(xiàn)BAX和BAK敲除對細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子p21和p16的基因和蛋白表達高低無影響，也不影響衰老相關(guān)標志物（SA-β-Gal和γH2A.X foci）、衰老相關(guān)的Lamin B1和HMGB1的表達、增殖標志物等的表達。這些結(jié)果表明，miMOMP通過BAX和BAK促進mtDNA釋放到胞漿并調(diào)控SASP，而不調(diào)控衰老相關(guān)細胞周期阻滯途徑。該結(jié)論進一步在體內(nèi)被證實，借助于條件性敲除BAX鼠（Bax^fl/flBak^-/-）和BAX和BAK雙敲鼠（Bax^-/-Bak^-/-），Bax^-/-Bak^-/-鼠顯著抑制了小鼠肝臟促炎細胞因子表達，且肝臟中CD68⁺免疫細胞以及CD45⁺CD68⁺免疫細胞數(shù)量顯著下降，且不影響p16和p21基因表達，表明BAX和BAK可調(diào)控衰老小鼠肝臟SASP分泌，但不影響衰老相關(guān)細胞細胞周期變化。

                                                                                                               圖3. miMOMP通過BAX和BAK促進mtDNA釋放到胞漿并調(diào)控SASP

4. mtDNA通過cGAS–STING調(diào)控SASP 

在細胞凋亡和其他應激條件下，胞漿mtDNA激活cGAS-STING信號通路，且cGAS-STING信號調(diào)控SASP，然而關(guān)于胞漿mtDNA釋放、cGAS-STING與SASP調(diào)控三者之間的聯(lián)系的研究仍然缺乏。為了探究這一問題，構(gòu)建了無線粒體細胞，即人成纖維細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)YFP-Parkin，并通過X射線輻照誘導細胞衰老。穩(wěn)轉(zhuǎn)YFP-Parkin人成纖維衰老細胞，用線粒體解偶聯(lián)劑（CCCP）處理，引起衰老細胞中的線粒體自噬從而耗盡細胞中的線粒體，然后用分離純化的mtDNA轉(zhuǎn)染無線粒體的衰老細胞，ELISA結(jié)果顯示胞漿mtDNA水平的增加顯著促進了無線粒體衰老細胞分泌的主要SASP因子IL-6和IL-8的增加。

                                                                                                                            圖4. mtDNA促進衰老細胞分泌SASP

接下來探討mtDNA促進SASP的機制，發(fā)現(xiàn)在衰老成纖維細胞中，GFP-cGAS融合蛋白與胞漿TFAM的共定位水平增加，利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除細胞中cGAS或STING，發(fā)現(xiàn)cGAS或STING的敲除顯著降低了衰老細胞SASP中IL-6和IL-8的分泌，而在野生型人成纖維細胞中轉(zhuǎn)染mtDNA后，顯著促進了衰老細胞SASP中IL-6和IL-8的分泌，這些數(shù)據(jù)表明mtDNA通過cGAS-STING調(diào)控SASP分泌。

                                                                                                                                  圖5. mtDNA通過cGAS–STING調(diào)控SASP的分泌

5. 抑制MOMP可改善健康壽命

接下來研究通過抑制MOMP是否能抑制mtDNA釋放和SASP分泌。研究團隊使用BAX小分子抑制劑BAI1抑制BAX活性，結(jié)果顯示，經(jīng)BAI1處理的衰老人成纖維細胞胞漿mtDNA和SASP相關(guān)基因表達被顯著抑制。那么，抑制MOMP是否可以改善衰老相關(guān)的肌肉力量的下降呢？通過轉(zhuǎn)棒實驗發(fā)現(xiàn)BAI1治療可改善與年齡相關(guān)的神經(jīng)肌肉協(xié)調(diào)能力下降，通過前肢握力實驗發(fā)現(xiàn)BAI1治療可增強衰老小鼠的前肢握力，顯著改善與衰老相關(guān)的肌肉力量下降。鑒于BAI1處理的老年小鼠中觀察到的肌肉骨骼表現(xiàn)的改善，進一步通過微計算機斷層掃描（μCT）分析來發(fā)現(xiàn)BAI1處理有效改善脊柱和股骨骨小梁微結(jié)構(gòu)，股骨體積分數(shù)顯著升高。

                                                                                                                                        圖6. 抑制MOMP可改善健康壽命

以上研究結(jié)果說明，細胞衰老和凋亡受到類似線粒體依賴性機制的調(diào)節(jié)，miMOMP可促進mtDNA調(diào)控SASP分泌，抑制miMOMP誘導的炎癥可能是改善健康壽命的一種治療途徑。

云克隆開發(fā)了上述研究中涉及到的相關(guān)靶標的蛋白、抗體以及試劑盒產(chǎn)品。靶標及核心貨號如下，供參考：