雙抗夾心法ELISA實(shí)驗(yàn)操作流程

雙抗夾心ELISA是檢測(cè)抗原最常用的方法。其基本原理是將特異性抗體（捕獲抗體）以物理吸附方式固定于微孔板表面，加入待測(cè)標(biāo)本后，標(biāo)本中的抗原與固相抗體特異性結(jié)合；洗滌后加入酶標(biāo)記的特異性抗體（檢測(cè)抗體），形成“捕獲抗體—抗原—檢測(cè)抗體”三元復(fù)合物；最后加入底物顯色，顏色的深淺與待測(cè)抗原的濃度呈正相關(guān)。

下面以云克隆雙抗夾心法商業(yè)試劑盒為例，詳細(xì)闡述ELISA的操作流程及技術(shù)要點(diǎn)，供廣大科研工作者參考。

一、試劑準(zhǔn)備

1. 使用前將所有的試劑和標(biāo)本緩慢均衡至室溫（18-25℃），如果該試劑盒在一段時(shí)間內(nèi)不能使用，請(qǐng)僅取出本次試驗(yàn)所需的酶標(biāo)條和試劑，并將剩余的酶標(biāo)條及試劑按指定條件保存。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入相應(yīng)體積標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（加入體積以說(shuō)明書(shū)介紹為準(zhǔn)），蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)輕輕搖動(dòng)（避免起泡）。先將其稀釋為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)最高濃度后，再準(zhǔn)備7個(gè)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP管，每個(gè)EP管中加入500μL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋?zhuān)瑯?biāo)準(zhǔn)品稀釋液（0pg/mL）直接作為空白孔。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋示意圖

3. 檢測(cè)溶液A及檢測(cè)溶液B：Detection A及Detection B在使用前請(qǐng)用手甩幾下或短暫離心處理，以使黏附在管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測(cè)稀釋液A或B 100倍稀釋（如：10μL檢測(cè)溶液A/990μL檢測(cè)稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100μL/孔），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2mL。

4. 濃洗滌液：580mL蒸餾水或去離子水加入20mL洗滌液（30×）稀釋至600mL至工作液濃度。

5. 底物溶液：請(qǐng)用滅菌的移液器和吸頭吸取所需體積的TMB至另一干凈容器中使用，容器中剩余的底物應(yīng)予丟棄，不要倒回TMB瓶中。

二、試劑準(zhǔn)備注意事項(xiàng)

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋不能直接在板中進(jìn)行。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品請(qǐng)于臨用前15分鐘內(nèi)配制。該標(biāo)準(zhǔn)品只能使用一次。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)使用相應(yīng)的稀釋液配制，稀釋液不能混用。用移液槍輕輕吹打充分混勻，避免起泡。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性請(qǐng)使用微量吸管，并校準(zhǔn)微量移液器。請(qǐng)依據(jù)所需的量精確配制，盡量不要使用微量配制的方法（如吸取檢測(cè)溶液A時(shí)，一次不要小于10μL），以避免造成濃度誤差。

4. 請(qǐng)勿重復(fù)使用已經(jīng)稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液A工作液和檢測(cè)溶液B工作液。

5. 洗滌液（30x）中如有結(jié)晶析出，請(qǐng)先溫育至室溫，輕輕混勻，至到結(jié)晶完全溶解再進(jìn)行配制。

6. 試劑盒中部分試劑為儲(chǔ)存液，客戶(hù)需配置成工作液后使用，在配置過(guò)程中可能因?yàn)榧儍羲|(zhì)量差或水質(zhì)污染，以及實(shí)驗(yàn)中所用耗材潔凈度差，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至完全錯(cuò)誤。請(qǐng)使用雙蒸水配置。

三、操作步驟

1. 加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（見(jiàn)試劑準(zhǔn)備）?？瞻卓准?/span>100μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，余孔加待測(cè)樣品100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1小時(shí)。

2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。

3. 每孔加檢測(cè)溶液A工作液100μL（臨用前配制），酶標(biāo)板覆膜，37℃溫育1小時(shí)。

4. 棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，在吸水紙上輕拍酶標(biāo)板來(lái)移除孔內(nèi)所有液體。重復(fù)洗板3次。最后一次洗滌后，吸取或倒出剩余的洗滌緩沖液，將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上，將殘留在孔內(nèi)的液體全部吸干。此過(guò)程也可采用噴射瓶，多道移液器 或自動(dòng)洗板機(jī)來(lái)完成。

5. 每孔加檢測(cè)溶液B工作液（臨用前配制）100μL，酶標(biāo)板覆膜，37℃溫育30分鐘。

6. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4。

7. 每孔加TMB底物溶液90μL，酶標(biāo)板覆膜，37℃避光顯色（反應(yīng)時(shí)間控制在10-20分鐘，不要超過(guò)30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時(shí)，即可終止）。

8. 每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請(qǐng)輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。

9. 在確保酶標(biāo)板底無(wú)水滴及孔內(nèi)無(wú)氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度值（O.D.值）。

四、操作步驟注意事項(xiàng)

1. 試劑準(zhǔn)備：準(zhǔn)備一次實(shí)驗(yàn)所需要的酶標(biāo)條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說(shuō)明書(shū)要求保存，以備下次使用。

2. 加樣：實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的滅菌吸頭，避免污染。加樣時(shí)注意不要有氣泡產(chǎn)生，將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。與反應(yīng)試劑加入一樣，加樣過(guò)程中第一個(gè)孔與最后一個(gè)孔加樣時(shí)間間隔盡量小（一般控制在10分鐘以?xún)?nèi)），如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時(shí)間，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。為了測(cè)值的準(zhǔn)確性，推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗(yàn)時(shí)請(qǐng)將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)，同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

4. 洗滌：充分洗滌非常重要，在每次洗滌過(guò)程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔內(nèi)殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將吸水紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要輕輕擦除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果使用自動(dòng)洗板機(jī)，請(qǐng)?jiān)谑炀毷褂煤笤儆糜谡綄?shí)驗(yàn)過(guò)程中。

5. 反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀(guān)察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘觀(guān)察一次），如觀(guān)察到顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

6. 底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

7. 如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)濕度低于60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。