競爭抑制ELISA實驗操作流程

小分子抗原或半抗原因僅有單個抗原表位，缺乏雙抗體夾心法所需的基本條件——具有2個或2個以上表位，所以對其常用競爭抑制ELISA進(jìn)行測定。其原理是將待檢抗原和酶標(biāo)抗原與相應(yīng)固相抗體競爭結(jié)合，標(biāo)本中抗原越多，與固相抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原越少，與底物反應(yīng)生成的顏色越淺，因此根據(jù)顏色深淺可定量測定。

下面以云克隆競爭抑制法商業(yè)試劑盒為例，詳細(xì)闡述ELISA的操作流程及技術(shù)要點，供廣大科研工作者參考。

一、試劑準(zhǔn)備

1. 使用前將所有的試劑和標(biāo)本緩慢均衡至室溫（18-25℃），如果該試劑盒在一段時間內(nèi)不能使用，請僅取出本次試驗所需的酶標(biāo)條和試劑，并將剩余的酶標(biāo)條及試劑按指定的條件保存。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：每瓶標(biāo)準(zhǔn)品加入相應(yīng)體積標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（加入體積以說明書介紹為準(zhǔn)），蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時輕輕搖動（避免起泡）。準(zhǔn)備5個稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的EP管，每個EP管中加入600μL的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，如圖所示依次三倍稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液（0pg/mL）直接作為空白孔。為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品三倍稀釋示意圖

3. 檢測溶液A及檢測溶液B：Detection A及Detection B在使用前請用手甩幾下或短暫離心處理，以使黏附在管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測稀釋液A或B 100倍稀釋（如：10μL檢測溶液A/990μL檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（100μL/孔），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2mL。

4. 濃洗滌液：580mL蒸餾水或去離子水加入20mL洗滌液（30×）稀釋至600mL至工作液濃度。

5. 底物溶液：請用滅菌的移液器和吸頭吸取所需體積的TMB至另一干凈容器中使用，容器中剩余的底物應(yīng)予丟棄，不要倒回TMB瓶中。

二、試劑準(zhǔn)備注意事項

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋不能直接在板中進(jìn)行。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品請于臨用前15分鐘內(nèi)配制。該標(biāo)準(zhǔn)品只能使用一次。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請使用相應(yīng)的稀釋液配制，稀釋液不能混用。用移液槍輕輕吹打充分混勻，避免起泡。為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性請使用微量吸管，并校準(zhǔn)微量移液器。請依據(jù)所需的量精確配制，盡量不要使用微量配制的方法（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10μL），以避免造成濃度誤差。

4. 請勿重復(fù)使用已經(jīng)稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A工作液和檢測溶液B工作液。

5. 洗滌液（30x）中如有結(jié)晶析出，請先溫育至室溫，輕輕混勻，至到結(jié)晶完全溶解再進(jìn)行配制。

6. 試劑盒中部分試劑為儲存液，客戶需配置成工作液后使用，在配置過程中可能因為純凈水質(zhì)量差或水質(zhì)污染，以及實驗中所用耗材潔凈度差，造成實驗結(jié)果不準(zhǔn)確，甚至完全錯誤。請使用雙蒸水配置。

三、操作步驟

1. 加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔5孔，依次加入50μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（見試劑準(zhǔn)備）?？瞻卓准?/span>50μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，余孔加待測樣品50μL，然后立即每孔加檢測溶液A工作液50μL，輕輕振動，混勻，注意不要有氣泡，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃溫育1小時。

2. 棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，在吸水紙上輕拍酶標(biāo)板來移除孔內(nèi)所有液體。重復(fù)洗板3次。最后一次洗滌后，吸取或倒出剩余的洗滌緩沖液，將酶標(biāo)板倒扣在吸水紙上，將殘留在孔內(nèi)的液體全部吸干。此過程也可采用噴射瓶，多道移液器 或自動洗板機來完成。

3. 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育30分鐘。

4. 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟2。

5. 每孔加底物溶液90μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37℃避光顯色（反應(yīng)時間控制在10-20分鐘，不要超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的后面3孔有明顯的梯度藍(lán)色，前3孔梯度不明顯時，即可終止）。

6. 每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。

7. 在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度（O.D.值）。

四、操作步驟注意事項

1. 試劑準(zhǔn)備：準(zhǔn)備一次實驗所需要的酶標(biāo)條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說明書要求保存，以備下次使用。

2. 加樣：實驗操作中請使用一次性的滅菌吸頭，避免污染。加樣時注意不要有氣泡產(chǎn)生，將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。與反應(yīng)試劑加入一樣，加樣過程中第一個孔與最后一個孔加樣時間間隔盡量?。ㄒ话憧刂圃?/span>10分鐘以內(nèi)），如果太大，將會導(dǎo)致不同的“預(yù)溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。為了測值的準(zhǔn)確性，推薦設(shè)置復(fù)孔進(jìn)行實驗。

3. 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時請將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)，同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的溫育時間和溫度。

4. 洗滌：充分洗滌非常重要，在每次洗滌過程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過程中反應(yīng)孔內(nèi)殘留的洗滌液應(yīng)在吸水紙上拍干，勿將吸水紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要輕輕擦除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。如果使用自動洗板機，請在熟練使用后再用于正式實驗過程中。

5. 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘觀察一次），如觀察到顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

6. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

7. 如果實驗室內(nèi)濕度低于60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。