原代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)流程繁瑣、細(xì)節(jié)性極強(qiáng)，為幫助廣大科研人避開實(shí)驗(yàn)雷區(qū)、高效推進(jìn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)度。本文依托云克隆原代細(xì)胞常見問題（FAQs），從核心概念、運(yùn)輸儲(chǔ)存、復(fù)蘇培養(yǎng)、傳代鑒定、培養(yǎng)基選擇、定制服務(wù)等全維度，系統(tǒng)梳理原代細(xì)胞從采購(gòu)到實(shí)驗(yàn)的完整流程，把最實(shí)用、最核心的知識(shí)點(diǎn)講透，助力每一位科研人輕松駕馭原代細(xì)胞。

一、原代細(xì)胞與細(xì)胞系，到底該選誰？

科研新手常糾結(jié)原代細(xì)胞與細(xì)胞系的選擇，二者核心差異決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度與應(yīng)用場(chǎng)景。原代細(xì)胞取自活體組織，保留體內(nèi)生理功能、分化狀態(tài)及信號(hào)通路，貼近真實(shí)生理環(huán)境，是機(jī)制研究、藥效評(píng)價(jià)、精準(zhǔn)建模的首選；細(xì)胞系經(jīng)永生化處理，但長(zhǎng)期傳代易出現(xiàn)遺傳漂變、表型異常，機(jī)制研究數(shù)據(jù)說服力較弱。想了解更多關(guān)于原代細(xì)胞和細(xì)胞系的差異，可查看《是原代細(xì)胞，還是細(xì)胞系？看這篇就夠了》。

二、原代細(xì)胞的運(yùn)輸、儲(chǔ)存與收貨處理

原代細(xì)胞的活性，是實(shí)驗(yàn)成功的前提，而運(yùn)輸與儲(chǔ)存環(huán)節(jié)，直接決定細(xì)胞活性高低。

1.原代細(xì)胞是怎么運(yùn)輸?shù)?/span>？

云克隆原代細(xì)胞采用標(biāo)準(zhǔn)化冷鏈運(yùn)輸：針對(duì)國(guó)外客戶，采用全程干冰運(yùn)輸，保證細(xì)胞全程處于超低溫環(huán)境，最大程度保護(hù)活性；針對(duì)國(guó)內(nèi)客戶，部分原代細(xì)胞可采用復(fù)蘇后常溫運(yùn)輸，收貨后可直接培養(yǎng)，更加便捷。

2.收貨原代細(xì)胞后，如何處理？

收到原代細(xì)胞后，立即處理，切勿拖延：

1）如果計(jì)劃立即開展實(shí)驗(yàn)，直接按照說明書進(jìn)行復(fù)蘇操作；

2）如果不能馬上實(shí)驗(yàn)，必須即刻放入液氮中長(zhǎng)期保存，這是最安全的保存方式；

3）若沒有液氮罐，可短期放置于- 80℃冰箱，但保存時(shí)間不要超過1個(gè)月，長(zhǎng)時(shí)間低溫保存可能會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷細(xì)胞活性，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.干冰揮發(fā)了，細(xì)胞還能用嗎？

1）若只是部分干冰揮發(fā)，凍存管仍處于低溫狀態(tài)，細(xì)胞活性通常不會(huì)受影響，可正常復(fù)蘇使用；

2）若干冰完全揮發(fā)，且凍存管已發(fā)現(xiàn)融化現(xiàn)象，說明細(xì)胞活性大概率受損，此時(shí)請(qǐng)及時(shí)拍照聯(lián)系我們，云克隆會(huì)提供專業(yè)售后處理，同時(shí)也可先復(fù)蘇觀察細(xì)胞狀態(tài)。

云克隆承諾，原代細(xì)胞復(fù)蘇后活力可保證在80%左右，不同類型細(xì)胞活力略有差異，具體可咨詢云克隆技術(shù)，讓實(shí)驗(yàn)更有保障。

三、培養(yǎng)核心要點(diǎn)：復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)基與細(xì)胞衰老判斷

1.復(fù)蘇與傳代，嚴(yán)格按說明書操作

不同類型原代細(xì)胞的特性差異極大，復(fù)蘇、離心、接種、傳代的條件也各不相同。云克隆每一款原代細(xì)胞產(chǎn)品，都配套詳細(xì)說明書，復(fù)蘇與傳代的具體步驟，嚴(yán)格參照原代細(xì)胞說明書【USAGE】部分執(zhí)行，不要隨意套用細(xì)胞系培養(yǎng)方法，這是保證細(xì)胞狀態(tài)的基礎(chǔ)。

2.原代細(xì)胞增殖傳代能力因細(xì)胞類型而有區(qū)別

原代細(xì)胞沒有永生化特性，傳代能力因類型、物種、年齡差異很大，提前了解傳代極限，避免無效培養(yǎng)：

1）不可增殖、不能傳代：神經(jīng)元、免疫細(xì)胞等，屬于終末分化細(xì)胞，只能使用P0代細(xì)胞，無法擴(kuò)增；

2）可傳2-3代：上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，適合短期實(shí)驗(yàn)；3）可傳5代及以上：成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等，部分間充質(zhì)干細(xì)胞甚至可傳至10代以上。

如果不確定所用細(xì)胞的傳代能力，直接咨詢云克隆技術(shù)，避免浪費(fèi)時(shí)間與細(xì)胞。

3.最佳實(shí)驗(yàn)代次：選對(duì)代次，數(shù)據(jù)更穩(wěn)定

1）常規(guī)可傳代原代細(xì)胞，建議使用P3代左右細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞剛完成復(fù)蘇恢復(fù)，狀態(tài)穩(wěn)定、活性最佳、表型未發(fā)生改變；

2）剛復(fù)蘇的P0代細(xì)胞，尚未完全適應(yīng)體外環(huán)境，狀態(tài)不穩(wěn)定；但是不可傳代的終末分化細(xì)胞，建議直接使用P0代開展實(shí)驗(yàn)

3）過高代次細(xì)胞，容易出現(xiàn)衰老、分化、表型漂移，數(shù)據(jù)不可靠；

4.培養(yǎng)基：專用配套培養(yǎng)基，效果遠(yuǎn)超通用培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是影響原代細(xì)胞狀態(tài)的核心因素，云克隆針對(duì)每一種原代細(xì)胞，都研發(fā)了專屬完全培養(yǎng)基，除基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分外，還添加了適配該細(xì)胞的生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)因子或添加劑等，經(jīng)過大量培養(yǎng)驗(yàn)證，是最適合該細(xì)胞的培養(yǎng)體系。

5.如何判斷細(xì)胞衰老？3個(gè)方法快速識(shí)別

原代細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)自然衰老，失去實(shí)驗(yàn)價(jià)值，可通過3種方式判斷：

1）形態(tài)學(xué)觀察：細(xì)胞突起變大、形態(tài)變得扁平寬大、輪廓模糊、增殖速率明顯下降；

2）染色鑒定：β-半乳糖苷酶染色，衰老細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)特異性陽性染色；

3）標(biāo)志物檢測(cè)：通過衰老相關(guān)基因、蛋白表達(dá)水平，精準(zhǔn)判定細(xì)胞衰老狀態(tài)。

一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞衰老，立即停止實(shí)驗(yàn)，更換新鮮細(xì)胞，避免無效數(shù)據(jù)。

四、細(xì)胞鑒定

科研實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞純度與鑒定是數(shù)據(jù)可信的前提，云克隆原代細(xì)胞，每一批次都完成嚴(yán)格質(zhì)量鑒定。

1）常規(guī)原代細(xì)胞：采用免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物，確認(rèn)細(xì)胞純度與類型；

2）干細(xì)胞類細(xì)胞：除表面標(biāo)志物鑒定外，還會(huì)進(jìn)行功能分化鑒定，如誘導(dǎo)成骨分化、成脂分化，通過染色驗(yàn)證干細(xì)胞多向分化潛能，保證干細(xì)胞功能完整。

所有鑒定結(jié)果，請(qǐng)查看原代細(xì)胞說明書【Figure】部分。

圖1.云克隆大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）形態(tài)及功能鑒定

圖2.云克隆大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）表面標(biāo)志物流式鑒定

五、實(shí)用問題解答

1.原代細(xì)胞可以再次凍存嗎？

不是所有細(xì)胞都適合二次凍存：

1）不推薦：神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、生長(zhǎng)緩慢的內(nèi)皮細(xì)胞等，擴(kuò)增后再次凍存，活性損失極大；

2）可以：成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等，增殖能力強(qiáng)，可擴(kuò)增后規(guī)范凍存?zhèn)溆谩?/span>

2.如何保證原代細(xì)胞分離活性？

云克隆從源頭把控細(xì)胞活性：采用新鮮活體組織提取，全程無菌操作，低溫冰上處理，嚴(yán)格控制消化酶濃度、消化時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)化操作手法，最大程度減少細(xì)胞損傷，保證細(xì)胞高活性。

3.原代細(xì)胞貨期多久？可以定制嗎？

云克隆擁有大量原代細(xì)胞現(xiàn)貨庫(kù)存，常規(guī)產(chǎn)品快速發(fā)貨，大幅縮短等待時(shí)間；同時(shí)支持個(gè)性化定制服務(wù)，可根據(jù)需求提供指定物種、細(xì)胞類型、疾病模型等定制化產(chǎn)品，評(píng)估后明確價(jià)格與周期，按時(shí)保質(zhì)交付。

4.有永生化原代細(xì)胞嗎？

永生化是細(xì)胞突破分裂限制、獲得無限增殖能力的過程，云克隆原代細(xì)胞均未進(jìn)行永生化改造，保持原生生物學(xué)特性，最大程度貼近體內(nèi)生理狀態(tài)，保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可靠。

5.原代細(xì)胞保質(zhì)期多久？

理論上，細(xì)胞在液氮中可長(zhǎng)期保存，但細(xì)胞活性會(huì)隨儲(chǔ)存時(shí)間略有下降，建議收貨后盡早開展實(shí)驗(yàn)，避免長(zhǎng)期儲(chǔ)存影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。