類器官模型及其特異性生物標(biāo)志物：精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的體外驗(yàn)證新范式

精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展迫切需要能夠真實(shí)反映人類生理和病理狀態(tài)的體外模型。數(shù)十年來，研究者們一直致力于通過各種體外模型和動(dòng)物模型來模擬人類疾病，但始終面臨著難以逾越的瓶頸。傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)無法再現(xiàn)三維組織微環(huán)境，而動(dòng)物模型存在顯著的種屬差異。正是在這一背景下，類器官技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。自2009年Hans Clevers等人首次從LGR5?腸道干細(xì)胞中建立三維上皮類器官以來^[1]，類器官研究進(jìn)入了快速發(fā)展的軌道。類器官憑借其能夠重現(xiàn)人體組織的復(fù)雜性和異質(zhì)性，正在重塑生物醫(yī)學(xué)研究的基本范式。

1、類器官模型概述

1.1 類器官的定義

類器官是一種在體外利用干細(xì)胞或組織細(xì)胞自組織形成的三維微型結(jié)構(gòu)，能夠高度模擬真實(shí)器官的細(xì)胞組成、空間結(jié)構(gòu)及部分生理功能。這一技術(shù)突破了傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)無法再現(xiàn)組織復(fù)雜性以及動(dòng)物模型存在種屬差異的局限，為疾病發(fā)生機(jī)制研究、個(gè)性化藥物篩選、毒性測(cè)試提供了更接近人體生理的模型平臺(tái)，同時(shí)有望成為再生醫(yī)學(xué)中替代受損器官的潛在移植物來源，從而極大地推動(dòng)精準(zhǔn)醫(yī)療和新藥研發(fā)的進(jìn)程。

1.2 類器官的細(xì)胞來源

類器官的細(xì)胞來源主要包括三類：一是多能干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞（ESC）和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC），它們經(jīng)定向分化可模擬多種器官發(fā)育；二是成體干細(xì)胞（ASC），直接從特定組織（如腸道、肝臟、乳腺等）中分離，利用其自我更新和分化能力形成相應(yīng)組織的類器官；三是來自患者的腫瘤組織或活檢樣本，其中含有的癌干細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞可構(gòu)建腫瘤類器官，用于藥物篩選和個(gè)體化治療研究。

1.3 類器官的類型

按照器官類型劃分，目前已經(jīng)成功構(gòu)建的類器官涵蓋了幾乎所有重要的人體器官系統(tǒng)，包括肝類器官、心臟類器官、腦類器官、胃腸道類器官、肺類器官以及各類腫瘤類器官等。這些三維培養(yǎng)系統(tǒng)在疾病建模、生物樣本庫、腫瘤起始與進(jìn)展研究、藥物檢測(cè)、免疫療法開發(fā)及再生醫(yī)學(xué)方面展現(xiàn)出巨大潛力。

2、主要類型類器官的特異性驗(yàn)證生物標(biāo)志物

細(xì)胞身份確證是類器官研究中最核心的科學(xué)問題之一。譜系特異性標(biāo)志物的正確選擇和應(yīng)用，是驗(yàn)證類器官分化質(zhì)量和評(píng)估其生理相關(guān)性的關(guān)鍵。在類器官中，細(xì)胞的分化狀態(tài)并非靜態(tài)的——多能干細(xì)胞來源類器官通常經(jīng)歷從干/祖細(xì)胞表型向成熟細(xì)胞表型的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)變，而標(biāo)志物表達(dá)的時(shí)序動(dòng)態(tài)直接影響對(duì)類器官“成熟度”的判斷。

2.1 腦類器官

腦類器官模型中，不同腦區(qū)的特化受到區(qū)域特異性轉(zhuǎn)錄因子和分泌因子的精準(zhǔn)調(diào)控，并可通過獨(dú)特的生物標(biāo)志物進(jìn)行識(shí)別。早期神經(jīng)上皮祖細(xì)胞高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子SOX2，而放射狀膠質(zhì)細(xì)胞則特征性地表達(dá)PAX6；這些祖細(xì)胞進(jìn)一步分化為中間前體細(xì)胞，其標(biāo)志物為TBR2；隨著神經(jīng)元的成熟，早期神經(jīng)元普遍表達(dá)TUBb3，成熟皮層神經(jīng)元依據(jù)亞型差異，深層表達(dá)CTIP2和TBR1，淺層則表達(dá)SATB2；腹側(cè)來源的中間神經(jīng)元特異性表達(dá)NKX2.1；星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)GFAP，少突膠質(zhì)細(xì)胞前體表達(dá)OLIG2，成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞則表達(dá)MBP；此外，脈絡(luò)叢細(xì)胞特異性表達(dá)TTR。

圖1 人類大腦類器官能夠重現(xiàn)大腦各區(qū)域的特征

（圖片源于《Nature》^[2]）

2.2 肝類器官

肝類器官模型能夠模擬肝臟發(fā)育過程，其中不同分化階段的細(xì)胞具有特異性的生物標(biāo)志物：肝祖細(xì)胞作為多能前體，高表達(dá)EpCAM、CK19和AFP，標(biāo)志著其雙向分化潛能；隨著進(jìn)一步分化，成熟肝細(xì)胞特異性表達(dá)ALB、HNF4α、CYP3A4，這些標(biāo)志物共同反映了肝細(xì)胞的合成代謝和解毒功能；膽管細(xì)胞則通過表達(dá)SOX9、CK7、CK19來界定其身份。此外，非實(shí)質(zhì)細(xì)胞也在高級(jí)類器官模型中被成功整合：肝星狀細(xì)胞表達(dá)GFAP、DES，活化后則驅(qū)動(dòng)纖維化過程；而庫普弗細(xì)胞，作為肝臟常駐巨噬細(xì)胞，其特異性標(biāo)志物包括CD68、VSIG4，在免疫監(jiān)視和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖2 人類胚胎干細(xì)胞衍生的可擴(kuò)展肝類器官

（圖片源于《Cell Res》^[3]）

2.3 腎類器官

腎類器官模型在體外模擬人類腎臟發(fā)育過程中，能夠自組織形成包含多種腎單位結(jié)構(gòu)的復(fù)雜三維組織。足細(xì)胞作為腎小球?yàn)V過屏障的關(guān)鍵組分，其成熟標(biāo)志物主要包括轉(zhuǎn)錄因子WT1以及結(jié)構(gòu)蛋白NPHS1和PODXL；近端小管上皮細(xì)胞則通過LTL結(jié)合其細(xì)胞表面的糖基化受體而被特異性識(shí)別，CUBN也常作為近端小管的補(bǔ)充標(biāo)志物；遠(yuǎn)端小管則表達(dá)ECAD；而PAX2作為早期腎系譜的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在發(fā)育早期的輸尿管芽和間充質(zhì)中均有表達(dá)，但在成熟類器官中其表達(dá)趨于局限。

圖3 腎類器官在培養(yǎng)過程中隨著時(shí)間的推移逐漸成熟

（圖片源于《Nature》^[4]）

2.4 腸類器官

在腸類器官模型中，不同細(xì)胞類型的特異性生物標(biāo)志物可用于精準(zhǔn)追蹤其發(fā)育分化過程。位于隱窩基底部的腸道干細(xì)胞以LGR5、OLFM4為標(biāo)志性分子，維持著持續(xù)的自我更新能力；這些干細(xì)胞向分泌譜系分化時(shí)，可形成潘氏細(xì)胞，其特征性表達(dá)LYZ、DEFA5/6；另一類重要的分泌細(xì)胞是杯狀細(xì)胞，主要通過大量合成并分泌黏蛋白MUC2而被識(shí)別，同時(shí)高表達(dá)TFF3，共同調(diào)控黏液屏障的形成；腸內(nèi)分泌細(xì)胞則以CHGA和SYP為通用標(biāo)志物。

圖4 優(yōu)化的人類腸道類器官顯示出干性增強(qiáng)和細(xì)胞多樣性的提升

（圖片源于《Nat Commun》^[5]）

2.5 肺類器官

模型在體外模擬肺發(fā)育過程中可分化出多種特異性細(xì)胞類型，其標(biāo)志物具有高度時(shí)空特異性：早期前體細(xì)胞表達(dá)SOX2（遠(yuǎn)端氣道）和SOX9（多能祖細(xì)胞）；基底細(xì)胞特異性表達(dá)TP63和CK5；纖毛細(xì)胞高表達(dá)FOXJ1；杯狀細(xì)胞標(biāo)志物為MUC5AC；肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞（AT2）特異性表達(dá)SFTPC、ABCA3、LAMP3；肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞（AT1）則以HOPX、AQP5和PDPN為特征。

圖5 肺芽類器官異種移植分化潛力

（圖片源于《Nat Cell Biol》^[6]）

2.6 心臟類器官

心臟類器官模型在體外成功模擬了胚胎心臟發(fā)育的關(guān)鍵過程，能夠自發(fā)形成具有空間分區(qū)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。心室樣區(qū)域的細(xì)胞高表達(dá)MYL2、IRX4；而心房樣細(xì)胞則特異性表達(dá)MYL7、NR2F2；流出道區(qū)域富集TBX1；起搏細(xì)胞（竇房結(jié)樣細(xì)胞）特征性表達(dá)HCN4和TBX3。在非心肌細(xì)胞譜系方面，心內(nèi)皮細(xì)胞可通過CD31、CDH5等表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，而心外膜樣細(xì)胞則表達(dá)WT1。此外，源自心外膜的成纖維細(xì)胞標(biāo)志物包括波形蛋白VIM、THY1。核心心肌標(biāo)志物如TNNT2在類器官的心肌細(xì)胞中廣泛表達(dá)。

圖6 發(fā)育誘導(dǎo)通過自組織促進(jìn)心臟類器官心房和心室的形成

（圖片源于《Nat Commun》^[7]）

2.7 胃類器官

在胃類器官的發(fā)育分化過程中，不同細(xì)胞類型可通過特異性生物標(biāo)志物進(jìn)行精確識(shí)別：表達(dá)MUC5AC的表面黏液細(xì)胞構(gòu)成了胃腔的保護(hù)性黏液屏障，而表達(dá)MUC6的腺體基底黏液細(xì)胞則定位于腺體底部；主細(xì)胞以PGC和GIF為特征標(biāo)志，壁細(xì)胞則通過ATP4A/B離子通道蛋白被識(shí)別；表達(dá)GAST的G細(xì)胞和表達(dá)SST的D細(xì)胞代表了胃類器官中功能性的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞譜系。此外，干細(xì)胞/祖細(xì)胞群體通常共表達(dá)LGR5和SOX2。

圖7 誘導(dǎo)后不同時(shí)間胃類器官的熒光染色圖像

（圖片源于《Front Cell Infect Microbiol》^[8]）

2.8 腫瘤類器官

不同腫瘤類器官模型的特異性生物標(biāo)志物精準(zhǔn)反映了其對(duì)應(yīng)原發(fā)腫瘤的組織起源、分子亞型及功能狀態(tài)，構(gòu)成了類器官身份驗(yàn)證與功能研究的核心基礎(chǔ)。結(jié)直腸癌類器官通常高表達(dá)LGR5、OLFM4、Ki67和CDX2^[9]。乳腺癌類器官則依據(jù)其臨床分子分型表現(xiàn)出ERa、PGR、HER2、Ki67、EGFR以及ECAD和CK19等不同標(biāo)志物^[10]。肺腺癌類器官常表達(dá)TTF1和Napsin A，而肺鱗狀細(xì)胞癌類器官則特征性地表達(dá)p40和CK5/6^[11]。胃癌類器官普遍表達(dá)CDX2、CK20、CK7以及CEA^[12]。肝癌類器官常見的特異性標(biāo)志物包括AFP、GPC3、CK19以及EpCAM等^[13]。腎癌類器官模型中核心的標(biāo)志物是PAX8和PAX2，幾乎表達(dá)于所有腎細(xì)胞癌亞型；在此基礎(chǔ)上，需結(jié)合CA9、CD10、ECAD和VIM等標(biāo)志物進(jìn)行鑒定^[14]。這些特異性的生物標(biāo)志物譜不僅用于確認(rèn)類器官模型的保真度和質(zhì)量控制，更為深入理解腫瘤生物學(xué)、篩選靶向藥物及預(yù)測(cè)個(gè)體化治療反應(yīng)提供了不可或缺的分子基礎(chǔ)。

3、挑戰(zhàn)與展望

當(dāng)前類器官驗(yàn)證體系面臨的核心挑戰(zhàn)之一在于標(biāo)準(zhǔn)化不足。類器官標(biāo)志物的選擇常因?qū)嶒?yàn)室條件、培養(yǎng)方案和干細(xì)胞來源的差異而高度不一致，且不同細(xì)胞來源在標(biāo)志物表達(dá)譜上存在本質(zhì)差異——PSC來源類器官更接近胚胎發(fā)育狀態(tài)，而ASC來源更接近成體穩(wěn)態(tài)，二者在驗(yàn)證時(shí)需采用相應(yīng)的生理參考系。從更長遠(yuǎn)的角度審視，類器官驗(yàn)證策略必須超越形態(tài)學(xué)和基礎(chǔ)標(biāo)志物檢測(cè)的界限。多組分生物打印、器官芯片共培養(yǎng)以及多組學(xué)整合預(yù)測(cè)等前沿技術(shù)的融合，將在更精細(xì)的特異性驗(yàn)證和更可靠的生理模擬層面上，最終決定類器官能否真正從“結(jié)構(gòu)模擬”邁向“功能替代”的關(guān)鍵一步。

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